上海酶联生物在我司原代细胞操作中【zhōng】，我们都认【rèn】为实验【yàn】的原理【lǐ】似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间【jiān】中【zhōng】夹杂着洗【xǐ】涤【dí】和封闭。 

　　原代细胞培养实验步骤：

 

　　1、取7-10d雄性SD大【dà】鼠，颈【jǐng】椎脱臼处死,浸泡【pào】于75%乙醇消毒3-5min。
 

　　2、在超【chāo】净工作台【tái】中【zhōng】，将大鼠【shǔ】断头置于玻【bō】璃【lí】培养【yǎng】皿中，打开【kāi】颅腔后取出【chū】全脑,放在盛有预冷的【de】PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。
 

　　3、将大脑半球【qiú】在【zài】干滤纸上【shàng】缓慢滚动【dòng】以去除软脑膜和脑【nǎo】膜【mó】大【dà】血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。
 

　　4、用细【xì】解【jiě】剖镊去除大脑白【bái】质、残余大血管和【hé】软脑膜【mó】，保留大脑【nǎo】皮质。
 

　　5、大脑皮质放于【yú】DMEM中(含庆【qìng】-大霉素【sù】和谷-氨酰【xiān】胺 )，剪碎成约1mm3大小【xiǎo】，放入50ml的【de】离心管中，加【jiā】入【rù】混合酶【méi】液I(0.9-21 .1%II型胶【jiāo】原酶，0 .025-0 .05%IV型胶原酶【méi】，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化【huà】9-21.5h。
 

　　6、室温1 000×g离心8min，去【qù】上清【qīng】液。
 

　　7、沉淀中加入20%BSA重悬浮【fú】，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去【qù】上清。
 

　　8、沉【chén】淀加入4ml混合酶液II( 0.9-21.1%的胶【jiāo】原酶/分散酶，0.9-21.1%I型胶原酶【méi】，100-300U DNaseI )重【chóng】悬浮，混匀，37℃水浴消【xiāo】化0.5-1h，700×g室【shì】温离心6min，去上清液。
 

　　9、沉【chén】淀加入2ml DMEM(含【hán】庆-大霉素【sù】和谷-氨【ān】酰胺)培养液悬浮混匀，铺于经离心形成【chéng】连续梯【tī】度的12ml 50%Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。
 

　　10、靠近底部的红细【xì】胞层之上【shàng】的白的层面即为【wéi】纯化【huà】的【de】微血【xuè】管段，吸出后DMEM
 

　　加入DMEM*培养液(20%FBS，4ug/ml嘌呤【lìng】霉素 )重悬浮，接种于含【hán】5%的大鼠 血清37℃孵育【yù】过夜所制【zhì】备的细胞培养皿中，置于37℃、5%CO2培【péi】养箱内静【jìng】置培养24h后更换不【bú】含嘌呤霉素的混合【hé】培养基，随【suí】后隔天换液【yè】。
 

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