MOC1细胞系

MOC1细胞系

T150烧瓶 : 07-200-64

T75烧瓶 : 10-126-37

冷 冻 剂 : 03-374-059

45um过滤器 : 09-754-21

05% : sh30236.01

25% : sh30042.01

惰性谱线 : MOC1,22

侵略性线 : MOC2

IMDM : sh30228.02 Hams

营养混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清，特征-海克隆

目【mù】录 / 批【pī】次号 :  sh30071.03 / AWK24001

过滤【lǜ】1L过滤【lǜ】器瓶的过【guò】滤器 :  09-761-108

科学试剂目录编【biān】号【hào】 :  胰岛素【sù】：I6634-50mgH0135-1mg   

EMD微孔试剂目录编号 :  表皮生【shēng】长因【yīn】子(EGF)，重组【zǔ】人【rén】：01-107

细胞系特征

1. 惰性- MOC1：基于体内【nèi】研究的侵袭性【xìng】较低。如【rú】果从80%合流【liú】T150通【tōng】过1：12，需要9-21天才能达到【dào】80%合 流。与更具侵袭性【xìng】的【de】细胞系相比，MOC1细胞系：在收获时需要的时间更长。

2. 侵袭性- MOC2：基【jī】于体内研究【jiū】，更具侵袭性。如【rú】果从80%合流T150通过【guò】1：12，需【xū】要9-21天才能达【dá】到 80%合流。与惰性【xìng】细【xì】胞系相比，惰性细胞系更容易从烧瓶中分离出来。

从T150收集和传递细胞/80%融合

1. 将T150中的介质倒入倾倒瓶中

2. 用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。

3. 加入1.5ml 0.05%覆盖整个表面积，从而接触【chù】所有细胞(这【zhè】样做，使细胞不会暴露在【zài】)，，然后再【zài】应用1。

4. 放置【zhì】在37C培养箱【xiāng】中。侵袭【xí】性【xìng】细胞系【xì】孵育9-21分钟，惰性反应可达9-21 min，但在9-21 min后 检查。

5. 故意敲击烧瓶一侧的手掌几次，使细胞松动。

6. 在显【xiǎn】微【wēi】镜下检查，看细胞在【zài】培养基中【zhōng】是否能自由【yóu】漂浮【fú】。如果大多数没有，请放回37C培养箱中 再【zài】放【fàng】置【zhì】9-21分钟。尽量不要让细胞留，因为这样会杀死【sǐ】细胞。

7. 一旦所有或大部分细胞【bāo】漂浮，加入10ml IMDM MOC线培【péi】养基来中和反【fǎn】应【yīng】。

8. 移液管【guǎn】培养基【jī】和细胞从烧瓶【píng】中【zhōng】进入15ml的【de】锥形细胞到颗粒细胞。离心机，1000 RPM x 5 min。

9. 倒出上清液。

10. 以1：12的速度【dù】通过细【xì】胞-在另外12毫升【shēng】的培养基【jī】中重悬【xuán】细胞。

11. 从其中取出【chū】1ml，放入新的T150烧瓶中，总体积【jī】为22ml的【de】IMDM MOC系培养基(稀释1：12）

1２. 放【fàng】回【huí】37C的培养箱中生长。应【yīng】在9-21天内达到80%的【de】合流率。

冷冻细胞系

1. 从T150中收集细胞，如下图所示

2. 在15ml锥形管中旋转成颗粒(1000 RPM x5分钟）

3. 排出上清液

4. 点击15ml圆锥形管，重悬细胞

5. 加入【rù】1.5ml IMDM MOC系培【péi】养基，在培【péi】养基中【zhōng】重建细胞-保持冰上

6. 管【guǎn】入冰时【shí】缓慢加入1.5 ml冷冻介【jiè】质(在IMDM MOC线介质中制作冷冻介质-20%DMSO。例：20ml库存-加【jiā】入【rù】16ml IMDM MOC线培养 基【jī】和4ml DMSO。注【zhù】射器过【guò】滤器，使用um过滤【lǜ】器

7. 每份1毫升到3个冷冻瓶

8. 在-80摄氏度内储存不超过2周

9. 在9-21周内放入液氮溶液中

注：如果需要【yào】，可增加到2ml IMDM和2ml冷冻培养【yǎng】基，以储【chǔ】存在4个【gè】小瓶中【zhōng】。此外，在冷冻细胞 前计【jì】数细胞并记【jì】录在小瓶【píng】上。

解冻细胞系

1. 在解冻前，将21ml IMDM MOC线培养基【jī】加入到T150中【zhōng】(如果想解冻【dòng】成T75，则【zé】将【jiāng】10ml加入到T75 中）

2. 将液氮从冷冻瓶中取出，喷上含有70%酒精的小瓶进行清洗。

3. 将冷冻【dòng】瓶的下半部分放在37摄氏度的水浴中(不让盖子【zǐ】接触水【shuǐ】，以【yǐ】避免【miǎn】污【wū】染），直到 有一小块冰漂浮着。

4. 再次用【yòng】ETOH喷【pēn】洒【sǎ】冷冻瓶，然后放在引擎盖上。将1ml培养液移液管加【jiā】入到1ml细胞中，并将【jiāng】这【zhè】 些2ml加入【rù】到已经含有【yǒu】培养基的T150中(使【shǐ】一个T150总【zǒng】共有22ml)。

5. 在T150烧瓶中取一些培【péi】养基，冲【chōng】洗【xǐ】冷冻瓶，然后【hòu】平板放置，以确保所【suǒ】有残留【liú】的细胞都留在冷 冻瓶【píng】中。

注入小鼠侧腹（异位）所需细胞浓度：

MOC1：MOC22：(用0.15ml注射【shè】1e6细胞）=6.66e6细胞/ml

MOC2：(用0.15ml注射1e5细胞)=6.66e5细胞/ml

1. 用0获取细胞。如上所述。

2. 用IMDM MOC系培【péi】养基，将细胞旋转成50ml锥形【xíng】的颗粒(1000 RPM x5分钟)。 注：使用50ml锥【zhuī】形，允许小【xiǎo】尺【chǐ】寸【cùn】针抽【chōu】出细【xì】胞供注射。

3. 再次将细胞旋转成小【xiǎo】颗粒。倒出PBS上清液【yè】(不)。在计算体积的冰【bīng】PBS中【zhōng】重悬颗粒以达【dá】到 适当【dāng】的浓度，记住【zhù】灌注【zhù】上清后50ml锥【zhuī】形中还有 200ul。

4. 将50ml锥形冰转移，每只【zhī】小鼠【shǔ】皮下注射【shè】0.15ml(150ul)细胞。

5. 按照标准协议注入鼠标。我们用1毫【háo】升注【zhù】射器。我们用1.5英寸【cùn】21号【hào】针绘制细胞，并将针切换 到?英寸26号针进行注射【shè】。

6. 用10ml冰【bīng】水PBS重悬细胞颗粒【lì】(确保尽可能多地去【qù】除含有【yǒu】FCS的介质【zhì】)，再次将【jiāng】细【xì】胞旋转成【chéng】颗 粒(1000 RPM x5分钟)

7. 用9-21 ml冰PBS重悬【xuán】细胞颗粒【lì】再次清洗细胞(体【tǐ】积取决【jué】于颗【kē】粒的大小【xiǎo】，因为你将使【shǐ】用【yòng】这个体积 来计数细胞【bāo】）

8. 使用血细胞计数仪【yí】或自【zì】动【dòng】细胞计数器【qì】计【jì】数每毫升的细胞，使【shǐ】用台盼蓝来消【xiāo】除【chú】死亡细胞。使用 存在的细胞总数(细胞/mlx总PBS的mlPBS)，计算重悬细胞颗粒所需的体积，以达到6.66e6(MOC1，MOC22)或6. 66e5 cell/ml(MOC2)浓度【dù】。

例如：MOC1的细胞计数为： 2.8e6细胞/mlx5ml(PBS)=14e6细胞总数。14e6细胞【bāo】/ 6.66e6细胞/ml=2.1mlPBS将细胞颗粒悬【xuán】浮在其中【zhōng】。

1L媒体协议

将培养基为2：1 IMDM制成营养混合物

1. 解冻胎牛血清和宾州/链球菌在37摄氏度

2. 1L过滤瓶加入626ml IMDM和313ml营养混合物

3. 添加50毫升FCS

4. 添加10ml Penn流

5. 过滤器

6. 加入1ml5mg/ml胰岛素(或500ul，10mg/ml)

注：用10ml无【wú】菌H20稀释【shì】胰岛素50mg粉末，加50ul无菌1N盐【yán】酸，4C箔保存

7. 加入40ug

注：8. 添加5ug EGF

注：使EGF - make 1ug/ul原【yuán】液用无血清IMDM稀释，每升加【jiā】入【rù】5ul。在-80处存【cún】储等分。