鸭胚胎肝间质细胞永生化

鸭胚胎肝间质细胞永生化
细胞特性
1）来源：上海中科院动物研究所
2）含量：>5x105个/mL
3）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

鸭胚胎肝间质细胞永生化细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1)准备【bèi】鸭胚胎肝脏【zāng】间充质干【gàn】细【xì】胞*培养基（dmem 高糖和F12培【péi】养基1：1搭配，10%血清 ，1%双抗以及1％自己配置【zhì】的【de】间质细胞因子。）。
2)培养【yǎng】条件：气相：空【kōng】气，95%；二氧化碳，5%。温度【dù】：37摄氏度，培养箱湿【shī】度为【wéi】70%-80%。
3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：
1）复苏【sū】细胞【bāo】：将含有【yǒu】1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速【sù】摇晃【huǎng】解冻，离心管【guǎn】加入4mL培养基【jī】混合均匀。在1000RPM条【tiáo】件下【xià】离心9-21分钟，弃去【qù】上清液，补加1-2mL培养【yǎng】基后吹匀。然后将所有细胞悬液加【jiā】入T25培养瓶中培养，补加【jiā】培养【yǎng】基【jī】至6ml。
2）细胞传【chuán】代：如果细胞密【mì】度达【dá】80%-90%，即可进【jìn】行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃【qì】去培养上清，用不含【hán】钙、镁离子的【de】PBS润洗细胞9-21次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化9-21分【fèn】钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若【ruò】细胞大【dà】部分【fèn】变【biàn】圆并脱落【luò】，迅速【sù】拿【ná】回【huí】操作台，轻敲几下【xià】培养瓶后加2ml*培【péi】养基终止消【xiāo】化【huà】。
3.轻轻打匀【yún】后吸【xī】出，在1000RPM条件下离【lí】心5分【fèn】钟，弃去【qù】上【shàng】清液，加1-2mL培养液后吹匀。
4. 将细【xì】胞悬液按1：2到1:5比例分到【dào】新【xīn】的含6ml培养基【jī】的新皿【mǐn】中或者瓶中【zhōng】。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去【qù】培养基后，PBS清洗瓶底【dǐ】9-21次后【hòu】加入【rù】1ml胰酶，细胞变圆脱落【luò】后，加入2ml*培养基终止消【xiāo】化，可使用血球计数板【bǎn】计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用【yòng】血清【qīng】重悬浮，加【jiā】DMSO至终浓【nóng】度【dù】为10%。加入DMSO后迅速混匀，按【àn】每【měi】1ml的数量分配到【dào】冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每【měi】个冻【dòng】存【cún】管细胞【bāo】数目大于【yú】1X106个【gè】细胞冻存。
3．将【jiāng】冻【dòng】存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时【shí】以后转入液【yè】氮灌【guàn】储存。记录冻存【cún】管位置以便下【xià】次【cì】拿【ná】取。

注意事项： 
1. 收到【dào】细胞后，若【ruò】发【fā】现干冰已【yǐ】挥【huī】发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污【wū】染，请立即致【zhì】电我们。
2. 所有动物细胞【bāo】均视为【wéi】有潜在的生物危害性【xìng】，必须【xū】在二级生物【wù】安全台内操作【zuò】，并请注意防护【hù】，所有废液及接触过此细【xì】胞【bāo】的器皿需【xū】要灭【miè】菌后方能丢弃。
*次【cì】处理细胞时，在超【chāo】净工作台中打【dǎ】开瓶盖，用浸透75%的酒精棉球擦拭瓶口外【wài】侧，以【yǐ】防止溢出的培养基污染【rǎn】细胞【bāo】。

细胞介绍

间充质【zhì】干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于【yú】早期中胚层【céng】的一类多能干细胞, 在【zài】体内具有分布【bù】广【guǎng】泛, 体外能够大【dà】量扩增和【hé】免疫原【yuán】性低等【děng】特点【diǎn】, 是【shì】一种细【xì】胞治疗的理想种子细胞。自20世纪60年代【dài】，Friedenstein等发现在人骨髓【suǐ】长期培【péi】养中, 存在一种形态类似成【chéng】纤维细胞的贴壁生【shēng】长的细胞且移【yí】植【zhí】到小鼠体内具有【yǒu】成【chéng】骨能【néng】力和造血支【zhī】持【chí】作用, 将【jiāng】这种细胞命名为骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世纪90年代末, 人们【men】才【cái】成【chéng】功分离一种具有成骨、成软骨和成【chéng】脂肪能力的细胞, 称之【zhī】为间充质干细【xì】胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。
随后研究【jiū】者也从其他组织, 如脂肪、脐带【dài】、胎盘、肝脏、骨实【shí】质和肌肉【ròu】等【děng】中成功分【fèn】离获得间充质【zhì】干细胞【bāo】。作为一类成体干细胞中【zhōng】的间【jiān】充质【zhì】干细胞, 目前大部分的研究集中在【zài】人【rén】及大【dà】鼠【shǔ】、小鼠这两种模式动物上, 其他动物的间充质干细胞报道相对较【jiào】少。选取中国*家禽品种【zhǒng】鸭子为【wéi】实验材料, 以鸭胚胎肝脏【zāng】中的间充质干细胞为【wéi】研【yán】究对象, 对其进行分离培【péi】养鉴定, 进行增殖能力检【jiǎn】测及分化【huà】能【néng】力鉴定, 为【wéi】家禽【qín】干细胞【bāo】研究及【jí】畜禽遗【yí】传资源【yuán】保存【cún】提【tí】供借鉴【jiàn】及参考。鸭胚【pēi】胎肝间质细胞进行慢病毒转染【rǎn】8-12h，连【lián】续【xù】传【chuán】13代，采用高【gāo】浓度含嘌呤霉素培养【yǎng】基（4μg/mL）培【péi】养，筛选阳性克隆；筛选出阳性永生化【huà】鸭【yā】胚【pēi】胎肝间【jiān】质细胞。
 

鸭胚胎肝间质细胞永生化运输【shū】和保存：可选择干【gàn】冰运输及发送复苏存活细胞方式【shì】：（1）干冰运输，收到后立即【jí】转入液氮【dàn】冻存【cún】或直接复苏；（2）存活【huó】细胞，收到【dào】后应继续生长【zhǎng】，传代达到细胞【bāo】生长状【zhuàng】态良好时【shí】，再【zài】进【jìn】行冻存。具体操【cāo】作见细胞培养步骤。=

细胞用途：仅供使用。