ELISA方法【fǎ】现在已经被广泛【fàn】的应用于各种抗【kàng】原和【hé】抗体【tǐ】测定。抛开试剂盒本身质量外，我们【men】在实【shí】验中也有很多因素【sù】都会【huì】影响试验的正常【cháng】结果。其中最常出现的问题【tí】是【shì】显色淡，灵敏度偏低【dī】、重【chóng】复性【xìng】不佳、假阳性结果和假阴性结果，不管【guǎn】出【chū】现什么样的结【jié】果【guǒ】都会直接影响我们的实验结【jié】果。下【xià】面来分析【xī】ELISA实【shí】验非正常检测【cè】结果产生【shēng】的常见原因，并分析其解决办法【fǎ】，以提高检测质量【liàng】。

1、方法学的影响

ELISA 测定模式包括以下几种: 双抗体夹心【xīn】法、间【jiān】接法、双【shuāng】抗原夹心法、IgM 抗体【tǐ】捕捉法【fǎ】、竞【jìng】争【zhēng】抑制法, 其中【zhōng】竞【jìng】争【zhēng】抑制法因受操作时【shí】差【chà】所引起的竞争等因素的影响【xiǎng】, 结果重复性【xìng】较差【chà】, 质量较难控制。

2、试剂因素

试【shì】剂的选择　检测的原理均【jun1】基于抗【kàng】原抗【kàng】体反【fǎn】应。由于该反应【yīng】过程受多种因素的影响, 如普遍存在基【jī】质效应、交【jiāo】叉反应等, 因而检测结果难以溯源, 不同方法、不同试【shì】剂之【zhī】间甚至同一试剂不同【tóng】批号间结【jié】果均缺乏可【kě】比性。试【shì】剂质量【liàng】在很大程度【dù】上决【jué】定了检测的水平, 因此【cǐ】在引入新项【xiàng】目【mù】之前必须对试剂进【jìn】行严格的评估。试剂的【de】评估有以下几个步骤: (1) 确【què】定【dìng】开展该项目的必【bì】要性; (2) 了解该项【xiàng】目【mù】现有的检测方法和原理; (3) 在了解试【shì】剂的组成基【jī】础上选择多【duō】家【jiā】试剂盒进行比较【jiào】,判断标准参考方法或参考物质, 其次为临【lín】床的【de】满意度及机【jī】构的报告如各级室间质量评【píng】价、CDC 报【bào】告【gào】等; (4) 定期【qī】对检【jiǎn】测结果【guǒ】进行追踪【zōng】反馈直至最终认可【kě】该试剂【jì】。

3、样本因素

标本【běn】干扰因素【sù】包括内【nèi】源性干扰因素和外源性干【gàn】扰因素,前者包括类风湿因子、补体、异嗜性【xìng】抗体、自【zì】身抗体等【děng】, 后者包括【kuò】标本溶血、标【biāo】本被污染、标本贮存时间【jiān】过长【zhǎng】、标本凝固不全、冷冻标本【běn】的【de】反复冻【dòng】融【róng】等。其中外源性干扰因素是【shì】我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素, 而【ér】避免内【nèi】源性因素的干扰则【zé】主要【yào】通过选【xuǎn】择合适的试【shì】剂盒。在临床中遇到少【shǎo】见的【de】疑【yí】难病例【lì】时应当考虑到【dào】内源性【xìng】干扰【rǎo】因【yīn】素的存在。以【yǐ】下【xià】对外【wài】源性干【gàn】扰因素进行简要说明【míng】:

标本溶血　要注意避免出现【xiàn】严【yán】重溶血。血【xuè】红蛋【dàn】白中【zhōng】含有血红【hóng】素【sù】基团, 其具【jù】有类过氧化物的活【huó】性【xìng】, 因【yīn】此, 在以辣根过氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 为标记酶的ELISA 测定【dìng】中, 如果【guǒ】血清标本中血【xuè】红蛋白浓【nóng】度较高, 则其就很容易在温育过程中吸【xī】附于固相, 从而与后面加【jiā】入的底物反【fǎn】应显【xiǎn】色。

ELISA 操作步骤复杂【zá】, 操作不当将引起较大的误差。以下叙述【shù】各个【gè】步骤中的影【yǐng】响因素【sù】。加样器是【shì】一种比较精密【mì】的工具, 其在长时间使用时会【huì】因机【jī】械【xiè】磨【mó】损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不【bú】准, 尤其是对于样本量较【jiào】大的【de】临床【chuáng】实验室, 因此必【bì】须定期对【duì】加液器【qì】进行维护和校准【zhǔn】。每次加【jiā】不同的标本时均【jun1】需更【gèng】换吸【xī】嘴, 以免发生交叉污染。加样时速度不可太快, 避免将标本加在【zài】孔壁上部, 并注意不要溅出或产生气泡【pào】。加样时【shí】还应当【dāng】注意【yì】操作时差对结果的影响, 操作【zuò】时差是指加入标【biāo】本、试剂及混匀【yún】时间【jiān】的差【chà】异【yì】。操作时【shí】差【chà】在每个实验中都存在, 尤其是手【shǒu】工操作, 日常检测标本【běn】多达几百个,从加入第【dì】一个标本【běn】到最后【hòu】一个标本【běn】, 需几【jǐ】十分钟【zhōng】, 加入试剂【jì】及混匀等均存在【zài】着前后【hòu】时【shí】间差异, 使抗原抗【kàng】体反【fǎn】应和酶促反应时间【jiān】不一致, 操作时差对竞【jìng】争法检测的结【jié】果影响更【gèng】大, 在【zài】加【jiā】酶结合【hé】物【wù】和【hé】底物时【shí】可用定量多道。